En el laboratorio, los investigadores a menudo se enfrentan a la tediosa preparación de soluciones tampón.Reconocido por su excepcional capacidad de amortiguación y excelente solubilidad en agua, se ha vuelto indispensable en varias disciplinas científicas, incluida la biología molecular y la botánica.Su tendencia a reaccionar con ciertos iones metálicos (como el calcio y el magnesio) y a precipitarse en soluciones de etanol plantea importantes desafíos experimentales.En este artículo se proporciona un protocolo detallado para preparar 1M de fosfato de potasio tampón a pH 6.5, ofreciendo a los investigadores una solución fiable para sus necesidades experimentales.
El tampón de fosfato de potasio, también conocido como tampón de Gomorrah, consiste en una mezcla de fosfato de potasio monobásico (KH)2Oficina de trabajo4) y fosfato de potasio dibasico (K)2HPO4Este sistema de amortiguación ofrece varias ventajas: capacidad de amortiguación superior, alta solubilidad en agua y rentabilidad.Los investigadores deben ser conscientes de que este amortiguador reacciona con iones metálicos como el calcio y el magnesio, que puede inhibir la actividad enzimática y formar precipitados en soluciones de etanol, una consideración crítica para los experimentos de preparación de ácidos nucleicos.
A pesar de estas limitaciones, el fosfato de potasio tampón sigue siendo un elemento básico en la investigación científica.y protocolos de purificación de proteínasEl pH del amortiguador puede ajustarse con precisión modificando la relación de sus dos componentes fosfatados, lo que lo hace adaptable a diversos requisitos experimentales.
El siguiente protocolo detalla la preparación de un litro de tampón de fosfato de potasio de 1 M a pH 6.5:
| Reactivo | Peso molecular (g/mol) | Cantidad (g) | Concentración final (mM) |
|---|---|---|---|
| Fosfato de dihidrógeno de potasio (KH)2Oficina de trabajo4) | 136.09 | 95 | 698.067 |
| Fosfato de hidrógeno de dipotassio (K)2HPO4) | 174.18 | 52.5 | 301.412 |
Protocolo de preparación:
- Preparación inicial:Añadir 800 ml de agua destilada a un recipiente adecuado.
- Disolución de KH2Oficina de trabajo4:Se añaden 95 g de fosfato de potasio monobásico al agua y se agita continuamente hasta que se disuelva completamente.
- Disolución de K2HPO4:Incorporar 52,5 g de fosfato de potasio dibasico en la solución y seguir revolviendo.
- Ajuste del pH:Usando un medidor de pH calibrado, ajuste cuidadosamente la solución a un pH de 6,5 con ácido clorhídrico diluido o solución de hidróxido de potasio.Realice los ajustes gradualmente con una mezcla completa entre las adiciones.
- Ajuste final del volumen:La solución se agrega a un volumen final de un litro con agua destilada y se mezcla bien.
- Esterilización:Filtrar la solución a través de un filtro de membrana de 0,22 μm para la esterilización.
- El almacenamiento:Conservar el tampón filtrado a temperatura ambiente y a 4°C para almacenamiento prolongado.
- Calidad del reactivo:Se utilizarán reactivos de grado analítico o de mayor pureza para evitar la interferencia experimental por impurezas.
- Calidad del agua:Utilice agua destilada o desionizada de alta calidad para evitar la introducción de contaminantes.
- Calibración del medidor de pH:Siempre calibre el medidor de pH con tampones estándar antes de usarlo.
- Mezclado:Asegurar una mezcla minuciosa durante todas las etapas de preparación.
- Técnica aséptica:Mantenga estrictas condiciones de esterilidad durante la filtración.
- Condiciones de almacenamiento:Conservar en condiciones frescas y oscuras para preservar la integridad del amortiguador.
Los investigadores pueden mejorar la eficiencia experimental mediante la preparación de soluciones de base concentradas (5M o 10M) para su posterior dilución.El rango de pH del amortiguador puede modificarse alterando las proporciones de los componentes fosfatadosEn experimentos que involucren procesos sensibles a los metales, considere agregar EDTA como agente quelante.El control de la temperatura es esencial para aplicaciones sensibles al pH.
Si bien el tampón de fosfato de potasio sirve eficazmente a muchas aplicaciones, los sistemas de tampón alternativos pueden ser preferibles en circunstancias específicas.El amortiguador de Tris resulta valioso cuando la interferencia de fosfato es problemática, mientras que el tampón HEPES ofrece ventajas para aplicaciones de cultivo celular debido a su menor toxicidad celular.La selección del amortiguador debe basarse en los requisitos experimentales y en posibles consideraciones de interferencia..
Dominar la preparación de 1M de fosfato de potasio tampón a pH 6.5 representa una habilidad de laboratorio fundamental.Combinado con la comprensión de las propiedades y limitaciones del amortiguador, permite a los investigadores realizar experimentos con confianza y precisión.