Em ambientes laboratoriais, os investigadores têm muitas vezes de lidar com a tediosa preparação de soluções tampão.Reconhecido pela sua excepcional capacidade de amortecimento e excelente solubilidade em água, tornou-se indispensável em várias disciplinas científicas, incluindo biologia molecular e botânica.A sua tendência a reagir com certos íons metálicos (como o cálcio e o magnésio) e a precipitar-se em soluções de etanol apresenta desafios experimentais notáveis.Este artigo fornece um protocolo pormenorizado para a preparação de 1M tampão de fosfato de potássio a pH 6.5, oferecendo aos investigadores uma solução fiável para as suas necessidades experimentais.
O tampão de fosfato de potássio, também conhecido como tampão de Gomori, consiste numa mistura de fosfato de potássio monobásico (KH2P.O.4) e fosfato de potássio dibasico (K2HPO4Este sistema de amortecimento oferece várias vantagens: capacidade de amortecimento superior, alta solubilidade em água e custo-eficácia.Os investigadores devem estar cientes de que este amortecedor reage com íons metálicos como cálcio e magnésioA concentração de ácidos nucleicos em soluções de etanol é uma consideração crítica para os experimentos de preparação de ácidos nucleicos.
Apesar destas limitações, o fosfato de potássio é um elemento essencial da investigação científica e encontra amplas aplicações em reações bioquímicas, sistemas de cultura celular,e protocolos de purificação de proteínasO pH do amortecedor pode ser ajustado com precisão modificando a relação dos seus dois componentes fosfatados, tornando-o adaptável a diversas exigências experimentais.
O seguinte protocolo detalha a preparação de um litro de tampão de fosfato de potássio de 1 M a pH 6.5:
| Reagente | Peso molecular (g/mol) | Quantidade (g) | Concentração final (mM) |
|---|---|---|---|
| Difosfato de hidrogénio de potássio (KH)2P.O.4) | 136.09 | 95 | 698.067 |
| Fosfato de hidrogénio de dipotassio (K)2HPO4) | 174.18 | 52.5 | 301.412 |
Protocolo de preparação:
- Preparação inicial:Adicionar 800 ml de água destilada a um recipiente adequado.
- Dissolução da KH2P.O.4:Adicionar 95 g de fosfato de potássio monobásico à água, mexendo continuamente até à dissolução completa.
- Dissolução de K2HPO4:Incorporar 52,5 g de fosfato de potássio dibasico na solução, mexendo continuamente.
- Ajuste de pH:Usando um medidor de pH calibrado, ajustar cuidadosamente a solução para pH 6,5 com ácido clorídrico diluído ou hidróxido de potássio.Realizar ajustes gradualmente com mistura completa entre adições.
- Ajuste final do volume:A solução é levada a um volume final de um litro com água destilada e misturada bem.
- Esterilização:Filtrar a solução através de um filtro de membrana de 0,22 μm para esterilização.
- Armazenamento:Armazenar o tampão filtrado a temperatura ambiente.
- Qualidade do reagente:Usar reagentes de grau analítico ou de pureza superior para evitar interferências experimentais por impurezas.
- Qualidade da água:Use água destilada ou desionizada de alta qualidade para evitar a introdução de contaminantes.
- Calibração do medidor de pH:Sempre calibre o medidor de pH com tampões normais antes de o utilizar.
- Mistura:Assegurar uma mistura completa durante todas as fases de preparação.
- Técnica asséptica:Manter condições estéreis durante a filtragem.
- Condições de armazenagem:Armazenar em condições frescas e escuras para preservar a integridade do tampão.
Os investigadores podem aumentar a eficiência experimental preparando soluções de base concentradas (5M ou 10M) para diluição posterior.A gama de pH do tampão pode ser modificada alterando as proporções dos componentes fosfatadosEm experimentos envolvendo processos sensíveis a metais, considere a adição de EDTA como agente quelante.O controlo da temperatura é essencial para aplicações sensíveis ao pH.
Embora o tampão de fosfato de potássio sirva eficazmente a muitas aplicações, sistemas de tampão alternativos podem ser preferíveis em circunstâncias específicas.O tampão Tris é valioso quando a interferência de fosfato é problemática., enquanto o tampão HEPES oferece vantagens para aplicações de cultura celular devido à sua menor toxicidade celular.A selecção do amortecedor deve basear-se nos requisitos experimentais e nas considerações de interferência potencial..
Dominar a preparação de 1M de fosfato de potássio tampão a pH 6,5 representa uma habilidade de laboratório fundamental.combinado com a compreensão das propriedades e limitações do tampão, permite que os investigadores realizem experiências com confiança e precisão.